32 Pharmaceutical Technology SUPLEMENTO LIQUIDOS 2025 ner una caracterización estructural del producto lo más completa posible y para utilizar los datos como herramienta para perfeccionar el proceso de fabricación y producir un fármaco de la mejor calidad posible. La directriz ICH Q6B detalla los aspectos de la estructura molecular de los cuales se espera la caracterización. Caracterización estructural primaria En primer lugar, y quizás lo más importante, la directriz ICH Q6B requiere la determinación de la secuencia primaria de aminoácidos del producto (proteína o polipéptido). Esto es crucial, ya que una proteína recombinante o un péptido sintetizado debe tener una secuencia de aminoácidos conocida y específica para cumplir su función. No se proporciona una metodología precisa para realizar esto, pero los métodos modernos de secuenciación se basan en gran medida en la espectrometría de masas de vanguardia para proporcionar los datos más completos y precisos. Dependiendo del tipo de instrumento, los espectrómetros de masas (p. ej., los de geometría cuadrupolo de tiempo de vuelo [Q-TOF] e instrumentos similares) pueden generar valores de masa con una precisión de masa muy alta (bajas ppm). Esta alta precisión de masa, combinada con la capacidad de este tipo de instrumentos para fragmentar péptidos, genera información precisa de la secuencia. Las proteínas se digieren proteolíticamente para obtener péptidos mediante estrategias adaptadas a la proteína en estudio. Los péptidos se separan y analizan mediante cromatografía líquidaespectrometría de masas (LC-MS) en línea, y los datos de fragmentación generados se utilizan para determinar la secuencia del péptido y, en última instancia, de la proteína. Esto no significa que la MS pueda generar el 100 % de la cobertura de la secuencia. Puede haber regiones de la proteína donde la generación de péptidos sea difícil o donde los iones de los fragmentos sean débiles o ambiguos. En estos casos, se puede realizar la secuenciación en fase gaseosa de péptidos purificados (también conocida como secuenciación de Edman) para identificar secuencialmente los aminoácidos según sus posiciones de elución cromatográfica, tras un marcaje químico secuencial específico. Composición de aminoácidos La directriz ICH Q6B también exige investigar la composición general de aminoácidos del producto. Para ello, es necesario determinar las cantidades molares relativas de cada aminoácido en el producto. Esto se realiza típicamente mediante la cuantificación relativa de aminoácidos tras la hidrólisis ácida del producto y la separación cromatográfica de los aminoácidos liberados y derivatizados. La comparación con cantidades conocidas de aminoácidos estándar permite una cuantificación precisa de cada aminoácido. Se reconoce que ninguna condición de hidrólisis ácida es adecuada para todos los aminoácidos, por lo que esto debe tenerse en cuenta en términos de recuperación de aminoácidos y, de ser necesario, adoptar enfoques hidrolíticos alternativos.
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